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科學(xué)講堂

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    無菌實驗室的要求與日常管理

    發(fā)布時間:2022-03-18 來源:貴陽欣興星物資有限公司
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    • 實驗室設(shè)施


    開展無菌檢查及微生物限度檢查工作,首先要按照《藥品檢驗所實驗室質(zhì)量管理規(guī)范》及《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求,建立一個布局合理、使用方便、操作安全的無菌室,并且配有完善的實驗設(shè)施和管理制度。無菌檢查、微生物限度檢查以及接種室(接種對照菌、菌種傳代)均應(yīng)嚴(yán)格分開,具有危險性的毒株、毒素如破傷風(fēng)梭菌、黃曲霉毒素的實驗室需單獨(dú)使用,以便控制防止傳播。



    • 潔凈實驗室


    1.潔凈室的布局

    1.1根據(jù)樣品檢驗要求,一般應(yīng)至少包括更衣緩沖系統(tǒng)、微生物限度檢查室、無菌檢查室、陽性菌室和物流通道。

    1.2更衣系統(tǒng)應(yīng)至少包括一更(含更鞋)、二更(含洗手)、緩沖以及人流走廊等。

    1.3物流通道應(yīng)考慮凈污分流的布局,有條件的可設(shè)置污物走廊


    2.潔凈室的設(shè)計要求

    2.1凈化級別:潔凈走廊、檢查室、陽性菌室應(yīng)為一萬級;其他房間應(yīng)為十萬級

    2.2氣流組織:陽性菌室對走廊呈負(fù)壓,走廊對緩沖有5Pa的正壓;陽性菌室全排風(fēng)

    2.3電氣控制:控制開關(guān)外置;設(shè)置通訊系統(tǒng)


    3.結(jié)構(gòu)與要求:

    無菌潔凈室不宜設(shè)在底層,防潮、防霉、采光好,遠(yuǎn)離交通干道,廁所及污染區(qū),面積不超過10m2,高度不超過2.4m,由兩個緩沖間、操作間組成。操作間緩沖間之間應(yīng)有樣品傳遞窗,出入操作間和緩沖間的門不應(yīng)直對。無菌室內(nèi)應(yīng)六面光滑平整,無縫隙,不起灰,不落塵,耐腐蝕,易清洗,墻壁與地面、墻壁與天花板連接處應(yīng)呈凹弧形,操作間不得安裝下水道。
        無菌室內(nèi)的照明燈應(yīng)嵌裝在天花板內(nèi),采光面積要大,光照應(yīng)分布均勻,光照度不低于300勒克斯。緩沖間和操作間應(yīng)裝有紫外線殺菌燈(2-25w/m3)''用于空氣消毒。紫外線波長200-300nm者具有殺菌作用,其中以265-266nm殺菌作用最強(qiáng),這與DNA的吸收光譜范圍一致,其殺菌機(jī)理可能是在細(xì)菌細(xì)胞DNA中引起胸腺嘧啶雙聚體形成,從而干擾細(xì)菌細(xì)胞DNA復(fù)制,導(dǎo)致細(xì)菌變異死亡。紫外線殺菌燈1m以內(nèi)距離殺菌效果最佳,每次開燈照射時間為30min。應(yīng)定期檢查紫外線燈輻射強(qiáng)度,不得低于70μW·cm-21m距離。其缺點是穿透力弱,一張紙板可以阻礙光的透過,不能穿透固體物,故只能用作表面消毒及一些不耐熱或化學(xué)消毒劑物品的消毒。


    4.溫度、濕度
    無菌室內(nèi)溫度和相對濕度直接影響紫外殺菌燈的殺菌效果,故溫度最好控制在25±2℃,相對濕度40-60%。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng)保持對環(huán)境形成正壓,不低于49Pa。

    5.操作間
    無菌室內(nèi)應(yīng)安裝空氣除菌過濾層流裝置及調(diào)溫裝置。潔凈度要求:凈化工作臺潔凈度為100級,無菌室應(yīng)為10000級。
    操作間應(yīng)準(zhǔn)備乙醇燈(或煤氣燈),火柴,2%碘酊棉球及75%乙醇棉球、試管架、大小橡皮乳頭、砂輪、記號筆、無菌剪刀、鑷子、注射器等。微生物限度檢查無菌室操作間內(nèi)還應(yīng)有電子稱(感覺為0.1g,最大稱量為300g為宜),電動勻漿儀等。
    6.緩沖間
    緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆,消毒液,無菌衣,帽,口罩,拖鞋等,緩沖間內(nèi)不應(yīng)放置培養(yǎng)箱和其他雜物。


    (二)潔凈室的使用

    1.在實驗開始之前1小時啟動風(fēng)機(jī)系統(tǒng)(空調(diào)系統(tǒng)),并開啟空氣消毒裝置,消毒至少半小時后關(guān)閉

    2.觀察并確保潔凈室的壓差

    3.物品經(jīng)物流通道進(jìn)入潔凈室

    4.人員正確著裝后經(jīng)人流通道進(jìn)入潔凈室

    5.使用完畢,應(yīng)用消毒液清潔工作臺面。實驗人員在更衣室換下無菌工作衣后出潔凈工作室。開啟空氣消毒裝置,消毒至少半小時后,關(guān)閉潔凈工作室的控制開關(guān)。


    (三)潔凈室的清潔維護(hù)

    1.潔凈室的清潔維護(hù)分為日常維護(hù)、定期維護(hù)和不符合時的維護(hù)。

    2.日常維護(hù)由每次實驗的實驗人員進(jìn)行,維護(hù)的范圍為進(jìn)行實驗的潔凈工作室和輔助潔凈區(qū),維護(hù)的頻率為每次實驗后。

    3.定期維護(hù)由實驗室指定專人進(jìn)行,維護(hù)的范圍為所有潔凈工作室,維護(hù)的頻率為每二周一次。

    4.不符合時的維護(hù)由實驗人員進(jìn)行,維護(hù)的范圍為所有不符合的潔凈室,維護(hù)的時機(jī)為出現(xiàn)不符合時



    • 潔凈室的驗證


    1.驗證的項目:潔凈度、微生物數(shù)、換氣次數(shù)、靜壓差、照度、溫度、相對濕度


    2.驗證的技術(shù)要求


    驗證項目

    十萬級

    一萬級

    一百級

    溫度(℃)

    18-26

    20-24

    20-24

    相對濕度(%)

    45-65

    45-60

    45-60

    換氣次數(shù)(次/h)

    不小于15

    不小于25

    -

    壓差(pa)

    相對室外:10     有級差的潔凈室之間:5

    照度(Lx)

    主要工作室≥300   輔助工作室≥150

    懸浮粒子數(shù)(粒/m3

    ≥0.5um

    3500000

    350000

    3500

    ≥5um

    20000

    2000

    0

    浮游菌數(shù)(個/ m3

    500

    100

    5

    沉降菌(個/皿)

    10

    3

    1


    3.驗證的周期  建議每半年一次,也可根據(jù)潔凈室的使用頻率適當(dāng)增加驗證次數(shù)。

    4.驗證的方法  潔凈度和微生物數(shù):采用GB/T16292~16294-1996,其他項目:參照J(rèn)GJ71-90。

    5.驗證不符合項的處理

    5.1當(dāng)潔凈度、微生物數(shù)、換氣次數(shù)、靜壓差等指標(biāo)出現(xiàn)不符合時,應(yīng)停用潔凈室,對凈化系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整后,在重新驗證,直至符合規(guī)定才能重新啟用潔凈室。

    5.2當(dāng)溫度、相對濕度和照度等指標(biāo)出現(xiàn)不符合時,潔凈室可不必停用,但應(yīng)及時修復(fù)空調(diào)系統(tǒng)(或更換照明裝置),使其符合規(guī)定。

    二、實驗室管理:
    為保證實驗工作有序進(jìn)行,實驗室必須制定一系列實驗室管理制度。

    (一) 實驗室要求:
    1實驗室環(huán)境應(yīng)清潔、衛(wèi)生、安靜,實驗室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙和飲食。
    2實驗人員必須穿戴工作衣帽,工作服經(jīng)常洗滌、消毒、保持清潔。
    3操作前后或離開實驗室必須用肥皂或消毒液洗手。
    4發(fā)生菌液污染臺面或地面,應(yīng)立即用3%甲醛或5%碳酸等消毒液由外向內(nèi)傾覆其上,1小時后再擦拭,如為破傷風(fēng)梭菌,則應(yīng)隔夜后再擦洗。
    5工作衣、帽、口罩受到菌液污染時,應(yīng)立即脫下使污染部位包裹在內(nèi)部,高壓滅菌后再清洗。
    6如有傳染性培養(yǎng)物污染手部,應(yīng)先用75%乙醇棉球擦拭,再浸入0.1%新潔爾滅消毒液內(nèi)泡手,然后再用肥皂及清水徹底洗干凈。
    7接種環(huán)(針),每次使用前后,必須通過火焰滅菌,冷卻后方可接種培養(yǎng)物,接種帶有蠟質(zhì)、油質(zhì)的培養(yǎng)物或菌苔殘留多時,不應(yīng)立即在火焰上灼燒,應(yīng)先在內(nèi)焰里將油質(zhì)培養(yǎng)物烘干后再移至火焰上滅菌,以免活菌外濺污染環(huán)境及感染操作者。
    8帶菌的吸管應(yīng)浸泡在5%甲酚消毒液內(nèi)24h后取出清洗,帶菌的試管或培養(yǎng)物應(yīng)在121℃高壓滅菌30分鐘后再取出清洗。
    9在接種霉菌、放線菌時應(yīng)在鋪有浸過消毒液的紗布上操作,防止孢子散落傳播。
    10廢棄物的處理:


    1. 必須消除生物危害后,才能處理,一般使用高壓蒸汽滅菌,也可以采用直接焚燒。
    2. 污染性銳器(如一次性針頭)應(yīng)滅菌后處理,注意避免銳器扎傷。
    3. 污染性可重復(fù)使用的材料(如平皿)應(yīng)滅菌后清洗,宜使用不易破碎的材料。
    4. 工作服(含潔凈工作服)應(yīng)定期清洗,懷疑污染的工作服應(yīng)滅菌后清洗,潔凈工作服應(yīng)滅菌后使用。



    (二) 無菌操作要求:
    無菌操作是指在無菌的環(huán)境條件下,使用無菌器材,防止微生物污染的操作技術(shù)。即保持待檢樣品在操作時不被污染,又要防止被檢的微生物及陽性對照菌在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。從事無菌及微生物操作的工作人員必須經(jīng)過無菌技術(shù)及基礎(chǔ)微生物學(xué)專業(yè)知識的學(xué)習(xí)及培訓(xùn)才具備上崗操作的資格,微生物專業(yè)檢驗人員也不應(yīng)該頻繁地變換工作崗位。
    1.無菌室應(yīng)每次使用前后用0.1%苯扎溴銨溶液或2%甲醛液擦拭工作臺面及可能污染的死角,濕拖地面,打開無菌空氣過濾器及超凈工作臺的開關(guān)30分鐘,紫外線殺菌燈照射1小時。
    2.操作人員用肥皂洗手后進(jìn)入緩沖間換拖鞋,用75%乙醇棉球擦手,穿戴工作衣帽、口罩。將所需物品剝?nèi)ヅFぜ埣巴獍b,從傳遞窗移入操作間,再用0.1%苯扎溴銨溶液泡手后進(jìn)入操作間,在乙醇(或煤氣燈)火焰區(qū)(火焰高度3-5cm)操作。
    3供試品表面消毒,如為安瓿先用砂輪劃痕后用2%碘酒棉球擦拭,再用75%乙醇棉球擦拭、待干,也可以用消毒液浸泡消毒。
    4操作者勿用嘴直接吸吹吸管,防止致病菌感染操作人員及口中的雜菌污染供試品。
    5在無菌操作中切勿大幅度或快速動作、拖行,以免攪動空氣中塵埃微粒。
    6注射器如需回抽時,應(yīng)對著火焰吸入無菌空氣。
    7所用的器材如培養(yǎng)基、稀釋劑配制后經(jīng)濕熱滅菌121℃30分鐘,吸管培養(yǎng)皿等均應(yīng)洗滌,干燥,包扎后經(jīng)干熱滅菌160℃2小時才能使用。

    三、消毒劑的質(zhì)量控制 

    (一)消毒劑安全使用原則

    1.正確選擇消毒劑的種類,盡可能選擇低毒、低殘留的消毒劑。

    2.正確選擇使用濃度,確保消毒效果。

    3.正確選擇消毒方式,可以浸泡、擦拭或噴霧。

    4嚴(yán)格掌握消毒時間。

    5.定期更換,避免產(chǎn)生耐藥性。

    6.不聯(lián)用和混合使用。

    7消毒前,應(yīng)進(jìn)行清潔。


    (二)消毒劑的種類 

    1.高效消毒劑(HLD):能殺滅一切微生物(包括芽孢),常見的有過氧乙酸、甲醛、環(huán)氧乙烷和含氯消毒劑

    2.中效消毒劑(ILD):能殺滅抵抗力較強(qiáng)的結(jié)核桿菌和其他細(xì)菌、真菌和大多數(shù)病毒,常見的有乙醇、苯扎溴銨、碘酊和甲酚皂溶液等

    3.低效消毒劑(LLD):能殺滅除結(jié)核桿菌以外的抵抗力較弱的細(xì)菌以及抵抗力較弱的真菌(如念珠菌)和病毒(如流感病毒、艾滋病毒等),常見的有氯已定、三氯散和高錳酸鉀等


    • 消毒劑配制


    1.根據(jù)消毒劑使用區(qū)域和對象的不同,將消毒劑分成3類,分別是:

    第一類消毒劑,專用于普通實驗區(qū),僅用于物品外表面的消毒,常用的有聚維酮碘和石炭酸等;

    第二類消毒劑,專用于潔凈室的更衣室,僅用于佩戴手套的雙手消毒,常用的有苯扎溴銨和75%乙醇;

    第三類消毒劑,專用于無菌操作間,直接用于消毒直接接觸藥品的容器表面,也用于實驗操作過程中的手部消毒和實驗臺面消毒,常用的有聚維酮碘溶液和75%乙醇。

    2.配制

    第一類消毒劑的配制方法:不需使用無菌器具,可直接在普通實驗區(qū)按消毒劑使用說明書的配制方法,用純化水稀釋消毒劑的濃溶液后使用。

    第二類消毒劑的配制方法:不需使用無菌器具,應(yīng)在更衣室內(nèi)按消毒劑使用說明書的配制方法,用純化水稀釋消毒劑的濃溶液后使用。

    第三類消毒劑的配制方法:需要使用無菌器具并在無菌操作間內(nèi)配制。首先取一次性集菌過濾器一個,將排液口放置在滅菌過的錐形瓶上,將消毒劑濃溶液通過薄膜過濾的方式除菌。然后,按比例取滅菌后的純化水,稀釋濃溶液,制成可供使用的消毒劑。將此消毒劑倒入放置有無菌脫脂棉球的消毒劑缸中,得到可直接使用的消毒劑棉球。(該類消毒劑制備后,應(yīng)收集消毒劑中的微生物)


    四、環(huán)境監(jiān)控

    (一)目的

    確定工作臺面、設(shè)備表面的消毒效果和消毒頻次,確定潔凈室的綜合性能以及進(jìn)行維護(hù)的時機(jī),確定培養(yǎng)箱的污染情況,判斷是否有必要進(jìn)行徹底消毒。


    (二)環(huán)境監(jiān)控的對象

    1.樣品貯存的環(huán)境

    2.培養(yǎng)基制備的環(huán)境

    3.樣品制備和檢驗的環(huán)境

    4.培養(yǎng)的環(huán)境


    (三)環(huán)境監(jiān)控的方法

    1.表面微生物數(shù)


    • 擦拭法(棉拭子法)
    • 淋洗法
    • 影印盤法(RODAC法)


    2.空氣微生物數(shù)


    • 沉降菌法     浮游菌法



    浮游菌數(shù)的測定:采用浮游菌測定儀。
    沉降菌數(shù)測定:方法:無菌室及凈化工作臺面消毒擦拭后,打開層流凈化裝置及凈化工作臺開關(guān)30min,將營養(yǎng)瓊脂平板3個及玫瑰紅鈉瓊脂平板3個(直徑9cm),置凈化工作臺左、中、右各1個,開蓋暴露30min后將蓋蓋上,分別放在30-35℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h及25-28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h,細(xì)菌和真菌平均菌落數(shù)小于等于1個為100級。實驗室一旦被污染,潔凈度達(dá)不到要求,可以清洗或更換凈化工作臺過濾器,用甲醛或丙二醇、乳酸熏蒸消毒,方法:在支架上放一個燒杯(內(nèi)裝少許甲醛,8ml/平方米),下面放一個裝有少許乙醇的乙醇燈,點燃后,關(guān)閉門窗,乙醇用盡后燈自滅,甲醛蒸氣充滿無菌室,密閉24h。
    缺點:甲醛蒸氣易銹蝕儀器,對人有刺激,可用氨水噴霧中和,減少對人眼的刺激。

    (四)環(huán)境監(jiān)控的評價指標(biāo)

    1.表面微生物數(shù)

    1.1需氧嗜溫菌小于5cfu/cm2,合格

    1.2需氧嗜溫菌在5~25cfu/cm2之間,需進(jìn)一步調(diào)查

    1.3需氧嗜溫菌大于25cfu/cm2,不合格,應(yīng)立即消毒處理

    2.空氣微生物數(shù)

    沉降菌大于15cfu/板,應(yīng)暫停工作,進(jìn)行消毒

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